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Hibridação de Southern (DNA-DNA)

Publicado em 26/07/2005 

A técnica conhecida como hibridação de Southern  Como qualquer outra técnica de hibridação de ácidos nucleicos baseia-se na capacidade destas moléculas, quando em cadeias simples, se poderem associar formando cadeias duplas, estáveis, em resultado do estabelecimento de ligações de hidrogénio entre duas cadeias simples que apresentam sequências de nucleótidos com bases complementares. Quando as duas cadeias simples, que se associam, são de proveniência diferente, forma-se uma cadeia híbrida e daí o nome hibridação. A hibridação DNA-DNA permite detectar, especificamente, a presença de sequências de DNA que sejam complementares de uma sonda (probe), um fragmento, também ele de DNA, seleccionado de modo a permitir essa detecção específica. Conforme as exigências do protocolo, a sonda poe ser curta ou longa (com menos de 50 ou mais de 100 nucleótidos). Southern consiste então na transferência, por capilaridade, para uma membrana de nitrocelulose ou de nylon, das moléculas de DNA em que se pretende detectar a presença de sequências específicas, após a sua separação electroforética e desntauração no gel com uma base forte. Após fixação desse DNA na membrana, pelo calor ou irradiação com UV, obtém-se uma réplica do gel a usar na execução dos processos seguintes. Esses ocorrem a temperaturas elevadas e consistem na pré-hibridação com DNA não hómologo (para reduzir as hibridações não específicas), seguida de hibridação com sonda marcada. Lavagens posteriores da membrana permitem retirar o DNA da sonda, ligado mais fracamente, por hibridação não específica. Variáveis experimentais como a temperatura, o pH, a concentração de sais, a sequência de bases e o tamanho do fragmento usado como sonda, determinam a especificidade do processo de hibridação. 

 No caso de ser necessário realizar um rastreio de muitos clones, como é por exemplo o caso da pesquisa de uma determinada sequência entre os milhares de clones de um banco genómica, é recomendável usar o método de hibridação em colónia. Neste caso, as colónias transferidas para a membrana e é sobre essa membrana que estas são lisadas, de modo a libertarem os ácidos nucleicos, após o que o DNA é desnaturado e fixado à membrana. A continuação do processo é em tudo semelhante ao anteriormente descrito. As colónias que derem sinal de hibridação com a sonda albergam, presumivelmente, a sequência de interesse. Outra variante da hibridação DNA-DNA, é a hibridação em gotas (dot hybridization). Neste caso, não se realiza a restrição do DNA nem a separação dos fragmentos de restrição por electroforese; é o DNA total a sondar que se coloca, após desnaturação, em gotas, sobre a membrana onde será sondado.

A escolha da sonda é da máxima importância, pois determina a especificidade da hibridação. Uma vez que queremos detectar um dado gene ou fragmento de DNA específico, a sonda deverá ser uma molécula de DNA, obtida por exemplo por amplificação por PCR ou resultar de um processo de clonagem, que tenha uma sequência complementar do fragmento de DNA, ou gene, que se pretende detectar.

Esta técnica é bastante sensível e tem muitas aplicações possíveis. Permite, por exemplo, a detecção de um fragmento de DNA único, de entre misturas complexas de fragmentos que resultam do corte do DNA genómico com enzimas de restrição.

Outras aplicações importantes desta técnica são fazer a destrinça de estirpes bacterianas que diferem na sua constituição genética em técnicas de genotipagem, fazer a detecção de organismos patogénicos através da detecção da presença de genes característicos, tais como os genes envolvidos na síntese de toxinas.

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