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Western-blotting - imunodetecção de proteínas Básico

Publicado em 18/11/2005 

Western-blotting - procedimento experimental

Transferência

Após fracionamento em gel desnaturante de poliacrilamida, procede-se à transferência das proteínas para uma membrana de nitrocelulose. O processo é o seguinte:

  • Corta-se uma membrana de nitrocelulose e 4 folhas de papel Whatman com o tamanho exacto do gel de resolução, sendo o gel de concentração desprezado;
  • Bio_LabBio_LEGG_Electro_proteínas_9
  • Dispõe-se sobre o ânodo do aparelho de tranferência (por exemplo, da BioRad – Figura ao lado) 2 folhas de papel Whatman, embebidas em tampão (+)Tooltip, e, sobreposta a estas, a membrana de nitrocelulose, igualmente embebida em tampão (+)Tooltip;
  • Sobre a membrana coloca-se o gel e, por fim, duas follas Whatman embebidas em tampão (-)Tooltip;
  • O sistema montado deve ser cuidadosamente pressionado de modo a retirar bolhas de ar que eventualmente diminuam o contacto entre o gel de acrilamida e a membrana; o uso de membranas com poro 0,2 mM evitam a perda de proteínas de baixo peso molecular para as folhas de papel MM;
  • Coloca-se o eléctrodo negativo (cátodo);
  • Bio_LabBio_LEGG_Electro_proteínas_9.1
  • A transferência das proteínas inicia-se quando aplicada uma corrente constante ao sistema montado. A corrente aplicada, em geral, não deve exceder 0,8 mA/cm2 de area de gel. Para um mini-gel tipico (8 x 10 cm) aplica-se 60 mA, sendo, usualmente, 1h o tempo suficiente para uma transferência eficiente.

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