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Preparação e quantificação de extractos proteicos Intermédio

Publicado em 18/11/2005 

Preparação de extractos proteicos

  • Lavar (para lavar devem-se centrifugar as células durante 5 minutos à velocidade de 10000rpm e 4ºC, descartando no final o sobrenadante) duas vezes o material biológico de partida (pellet de células microbianas) com tampão 10 mM Tris base
  • A lise celular de bactérias será efectuada por uso de ultrassons. Após descongelar, o sedimento celular é resuspenso em 1ml de tampão de lise (10mM Tris base) e a suspensão celular resultante é sujeita a 15s de sonicação, seguidos de 1 min de repouso. Este processo é repetido 6 vezes. A suspensão de células lisadas é, em seguida, centrifugada durante 10 min a 6000 rpm e a 4ºC, para separar a solução proteica do sedimento contendo o debris celular. O sobrenadante, que corresponde ao extracto proteico, é transferido para novo tubo e guardado no gelo.
  • A lise celular das células de levedura será efectuada por ruptura mecânica. Ao sedimentode células adiciona-se igual volume de esferas de vidro (por exemplo Glass Beads; 425-600 μm; Sigma) e 500 μl de tampão de lise (10mM Tris-Base; Inibidores de proteases: (10μg/ml leupeptina; 1μg/ml pepstatina A; 20μg/ml aprotinina; 2μg/ml inibidor de tripsina/quimotripsina; 1.5μg/ml benzamidina; 1mM fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF)). Cada tubo é agitado num vortéx durante 30s e seguidamente colocado 30 s no gelo, sendo este processo repetido ao longo de 8 min. Em seguida, a mistura é colocada no gelo por 10 min e centrifugada 15 min, a 15000rpm e 4ºC, sendo o sobrenadante - o extracto proteico bruto - transferido para um novo tubo e guardado em gelo.
  • Para eliminar ou reduzir a quantidade de contaminantes precipita-se, selectivamente, as proteínas presentes nos extractos brutos, usando um kit comercial (por exemplo o 2-D Clean Up kit, da Amersham Biosciences) seguindo as instruções do fabricante;
  • Dissolvem-se os extractos proteicos em tampão de re-hidratação: 8 M ureia, 15 mM DTT, 2% CHAPS, 0.5% anfólitos (ex. Pharmalytes 3-10, Amersham Biosciences) e uns pós de azul de bromofenol. Deixa-se a solução durante  1h à temperatura ambiente para favorecer a ressupensão.

Quantificação dos extractos proteicos

  • A quantificação da proteína total nos extractos é feita usando um kit comercial (por exemplo, o 2D Quant kit, da Amersham Biosciences) seguindo as instruções do fabricante;

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