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Introdução de DNA recombinado na célula bacteriana Básico

Publicado em 13/12/2005 

Transformação de células bacterianas

A competência natural das bactérias para receber o DNA do meio circundante é um fenómeno raro (verificando-se apenas em determinadas espécies e em condições fisiológicas específicas). Assim, é necessário desenvolver essa capacidade, ou seja, é necessário tornar as células competentes para viabilizar a introdução do DNA recombinado (rDNA) no hospedeiro seleccionado. Ao processo de entrada de DNA livre (isto é, DNA em solução, fora do invólucro celular) na célula dá-se o nome de transformação.

A introdução de rDNA em células bacterianas (como por exemplo na estirpe Escherichia coli XLI-Blue) pode ser realizada recorrendo às técnicas de transformação clássica ou à electroporação.

Na transformação química (ou clássica) as células (principalmente de E. coli) são tornadas competentes, através dum mecanismo ainda por esclarecer, por incubação numa solução fria de cloreto de cálcio, a que se segue um choque térmico de curta duração. Se necessário é possível aumentar a eficiência do processoGlossário por recurso a outros iões monovalentes (K+ ou Rb+) ou divalentes (Mg2+ ou Mn 2+).

A electroporação ou electrotransformação, como alternativa à transformação clássica, assenta na electropermeabilização, reversível, das células bacterianas, por sujeição a um pulso eléctrico de elevada intensidade e curta duração. Esta técnica, que permite uma maior eficiência face à transformação química, garante também a introdução de DNA recombinado (rDNA) em espécies refractárias à transformação clássica, desde que as condições experimentais sejam devidamente optimizadas.

A conjugação é um processo natural de transferência de material genético entre bactérias, que pressupõe o contacto físico entre estas. A célula dadora é a célula que possui o rDNA, que queremos transferir para uma outra célula, dita receptora. Neste caso, o vector de clonagem a usar tem de poder ser mobilizável, ou seja, apresentar parte das funções de um vector conjugativo, que é autotransmissível. Por questões de segurança em Engenharia Genética, não é permitido o uso de vectores baseados em plasmídeos conjugativos, de modo a não viabilizar a sua transferência descontrolada para outras células bacterianas fora do laboratório e do controlo do manipulador. As funções que são retiradas aos plasmídeos conjugativos para os tornar não conjugativos terão de se encontrar presentes, durante a transferência por conjugação em laboratório, num plasmídeo ajudante, que pela sua co-presença, permitirá a associação entre a célula receptora e a célula dadora através do tubo de conjugação (ver figura). Este processo, envolvendo três células (a dadora com o rDNA, a receptora e a ajudante com o plasmídeo ajudante que apresenta as funções em falta no vector com o rDNA). De salientar que a célula receptora não apresenta o rDNA mas que, no final de um processo bem sucedido, ambas as células de conjugação apresentam o rDNA, podendo assim a célula receptora funcionar como dadora num novo processo de conjugação.

A transdução recorre também a um fenómeno natural: a infecção viral em bactérias. Assim, este processo utiliza um bacteriófago ou fago (vírus de bactérias) que serve de veículo para a introdução do rDNA, ao infectar a célula receptora, de uma forma controlada, no laboratório. No caso da bactéria E. coli, é possível utilizar o fago λ (fago desta espécie) num processo engenhoso que permite introduzir plasmídeos de grandes dimensões (cerca de 50 kb ou seja 50000 pares de bases). Para tal, estes plasmídeos têm que incluir uma região dita cos, de reconhecimento pelo fago. Estes vectores de clonagem designam-se, por isso, cosmídeos.

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