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Fusão genética FLR1::LacZ Intermédio

Publicado em 11/12/2008 

Ficha de Aprendizagem

Síntese

Este tópico demonstra como se pode construir uma fusão genética para análise da expressão de um gene por recurso a um gene repórter. Dá-se como exemplo a análise da expressão do gene FLR1 de Saccharomyces cerevisiae.

Palavras-chave
  • Engenharia genética
  • Quantificação da expressão genética
  • Fusão genética
  • Gene FLR1
  • Saccharomyces cerevisiae
Objectivos de aprendizagem

A aprendizagem neste tópico envolve os seguintes objectivos:

  • Construir uma fusão genética
  • Avaliar a expressão de um gene por recurso a um gene repórter.
Pré-requisitos

Os seguintes conhecimentos são essenciais para a compreensão deste tópico:

Uma das técnicas que permite estudar a regulação da expressão de um dado gene baseia-se na fusão da região promotora do gene de interesse com um gene, dito repórter, que codifique uma proteína cuja actividade enzimática é fácil de detectar e quantificar. Um exemplo de gene repórter é o gene lacZ que codifica a enzima β-galactosidase.

O gene lacZ é fundido à região promotora do gene FLR1, como esquematizado na figura 1. Assim, a quantificação da actividade β-galactosidase permite estimar a actividade do promotor do gene FLR1 e estudar a regulação da sua transcrição.

fusaogenetica1

Fig. 1 – Esquema da fusão genética FLR1::lacZ.

A região promotora do gene FLR1 é obtida por amplificação por reacção de PCR e clonada num vector de clonagem contendo o gene repórter lacZ. Para tal, foram desenhados iniciadores de PCR (R e F na figura 1), com base na sequência de nucleótidos da região promotora, recorrendo à base de dados SGD Link externo (Saccharomyces Genome Database) e de forma a introduzirem, de cada lado do produto de amplificação, os locais de restrição necessários à sua clonagem.

Para que a ligação do fragmento amplificado por PCR (contendo o promotor do gene FLR1) ao vector seja eficaz é necessário que os dois fragmentos tenham extremidades compatíveis ou coesivas. Para tal os dois fragmentos de DNA são digeridos com o mesmo conjunto de enzimas de restrição. Neste caso, dadas as características do vector usado, o pAJ152 (André et al., 1993), são usadas as enzimas de restrição HindIII e BamHI (figura 2).

fusaogenetica2

Fig. 2 - O vector de clonagem é linearizado com as enzimas de restrição BamHI e HindIII permitindo que se possa inserir, a montante da região codificante para o gene lacZ, o promotor do gene FLR1.

Os dois fragmentos de DNA, vector e amplificado, são sujeitos à acção da enzima DNA ligase que permitirá a obtenção de um novo plasmídeo intacto onde está inserida a região promotora a montante da região codificante do gene lacZ (figura 3).

fusaogenetica3

Fig. 3 – Esquema da clonagem da região promotora do gene FLR1 a montante do gene LacZ no plasmídeo PAJ152.

O DNA anterior é introduzido em células de E. coli, onde os plamídeos recircularizados (por inserção do fragmento de DNA correspondente ao promotor do gene FLR1), são seleccionados por conferirem às células da bactéria resistência ao antibiótico ampicilina (a marca de selecção do vector usado). A extracção de DNA destes clones de E. coli permite recuperar os plasmídeos e proceder à sua verificação por análise do seu mapa de restrição, e desta forma comprovar que contêm a inserção do promotor do gene FLR1 a montante do gene LacZ.

Os plasmídeos obtidos são então introduzidos em células de Saccharomyces cerevisiae por transformação. O gene URA3 inserido no vector permite complementar a auxotrofia URA3- da estirpe de levedura usada para este efeito, permitindo seleccionar os clones que passam a crescer em meio sem uracilo.

As células de levedura que albergam o plasmídeo contendo a fusão FLR1::LacZ podem ser usadas para estudar a regulação da expressão genética do gene FLR1 tal como descrito em Estudo da regulação genética do gene FLR1 (Brôco et al., 1999; Tenreiro et al., 2001).

Autor e Créditos

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Referências Bibliográficas

  • [1] N. Brôco, S. Tenreiro, C.A. Viegas e I. Sá-Correia, FLR1 gene (ORF YBR008c) is required for benomyl and methotrexate resistance in Saccharomyces cerevisiae and its benomyl-induced-expression is dependent on Pdr3 transcriptional regulator, Yeast, 15, 1595-1608, 1999.
  • [2] S. Tenreiro, A.R. Fernandes e I. Sá-Correia, Transcriptional activation of FLR1 gene during Saccharomyces cerevisiae adaptation to growth with benomyl: role of Yap1 and Pdr3, Biochem Biophy Res Commun, 280, 216-222, 2001.
 

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